几丁质是自然界中含量极为丰富的可再生资源,理化性质稳定且廉价易得,其降解产物几丁寡糖具有优良的性能,在诸多领域中被广泛应用。利用生物酶法降解几丁质获得几丁寡糖是环保高效的途径,逐渐成为研究的热点。但是,目前报道的几丁质酶表达量普遍不高,为满足工业化需求,降低生产成本,提升几丁质酶的表达水平成为利用几丁质资源的关键之一。本研究将四种几丁质酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行异源表达,初步探究四种几丁质酶的酶学性质及降解几丁质的性能,发现地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源的BlChiA2最优。通过对表达元件的替换和筛选及目的基因进行定向进化,最终获得表达量显著提高的突变体M5。最后将枯草芽孢杆菌工程菌进行3-L罐高密度发酵,实现了BlChiA2的高效分泌表达。主要研究结果如下:(1)几丁质酶基因的重组表达及降解几丁质。将高山芽孢杆菌来源的BaChiA、蜡状芽孢杆菌来源的BcChiA、地衣芽孢杆菌来源的BlChiA1和BlChiA2在Bacillus subtilis WS9中重组表达。结果显示BlChiA2酶活力最高Hepatocyte nuclear factor,为0.72 U·m L~(-1)。分别测定重组酶的酶学性质,发现BlChiA2具有最高的最适反应温度(60℃)和良好的热稳定性,具有工业化应用的潜力。随后进行几丁质降解实验并使用高效液相色谱(HPLC)检测产物类型,重组酶水解胶体几丁质的产物均为几丁二糖,表现出外切活性。BlChiA2对底物的降解效果最显著,以3%(v·v~(-1))的加酶量反应3 h生成几丁二糖产率可达66.7%。(2)表达元件的筛选及重组菌3-L罐高密度发酵。选择枯草芽孢杆菌内源性强启动子替换载体pHY300PLK上原有的启动子P_(Hpa Ⅱ)-P_(amy Q),其中含P_(SpoVG)的重组菌株具有最高的几丁质酶活力,为0.96 U·m L~(-1)。随后利用B.subtilis Secretory Protein Expression System试剂盒中含有的173种Sec分泌途径信号肽,建立信号肽文库并进行高通量筛选。经96孔板初筛和摇瓶发酵复筛,获得使BlChiA2分泌表达能力提高的信号肽SP_(YqxI)。将P_(SpoVG)与SP_(YqxI)连接构建工程菌,摇瓶发酵的酶活力为1.40 U·m L~(-1),是出发菌株几丁质酶活力的1.94倍。3-L罐高密度发酵在56 h测得最高几丁质酶活力,为7.78 U·m L~(-1),是摇瓶发酵酶活力的5.56倍。(3)几丁质酶基因BlChiA2的定向进化及重组菌3-L罐高密度发酵。采用易错PCR在目的基因中随机引入突变,建立突变体文库并进行筛选。通过几丁质平板透明圈实验初筛和发酵复筛,最终获得四个优势突变体。根据突变位点所在的不同结构域,构建突变体M1并以此为基础构建组合突变,其中突MLN8237试剂变体M5(D26N/E336K/E469G/A472T)的酶活力最高,从野生型的1.40 U·m L~(-1)提高到2.97 U·m L~(-1)。同时M5具有更广泛的p H耐受性。针对野生型及M5进行分子动力学(MD)模拟,新的氢键作用力和表面电荷的变化等因素有利于提升可PUN30119半抑制浓度溶性表达及在溶液中的稳定性。随后对M5的重组工程菌进行3-L罐高密度发酵,发酵罐水平的最高酶活力为18.06 U·m L~(-1),是摇瓶发酵水平的6.1倍,并提高至对照菌株高密度发酵酶活力的2.3倍。