目的:1.明确三七总皂苷(PNS)对脑缺血再灌注损伤(CIRI)中铁死亡和炎症反应的调控作用。2.基于Nrf2负性调控铁死亡途径揭示PNS抗脑缺血再灌注炎症损伤作用机制。方法:1.明确PNS对Erastin和氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡的调控作用。体外分别构建AG-221供应商Erastin和OGD/R诱导的细胞铁死亡模型,实验分对照组,模型组,PNS低、中、高剂量组,铁死亡抑制剂(Fer-1)组、铁螯合剂(DFO)组;通过CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测评价各组细胞损伤程度;检测Fe~(2+)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)以及活性氧(ROS)等铁Genetic affinity死亡关键指标的变化。2.明确PNS对中动脉闭塞/复灌注(MCAO/R)大鼠脑组织中铁死亡和炎症反应的作用。构建MCAO/R诱导的大鼠CIRI模型,实验分假手术组,MCAO/R组,PNS低、中、高剂量组,Fer-1组,DFO组;缺血2h复灌24h后,通过神经功能缺损评分、平衡木、攀绳肌力、黏贴片移除、圆筒实验的行为学指标以及TTC染色检测评价脑损伤程度;试剂盒检测Fe~(2+)、GSH、MDA以及脂质过氧化物(LPO)等铁死亡关键指标的变化,运用Western blot检测铁死亡主要调控蛋白水平。试剂盒检测白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及髓系过氧化物酶(MPO)等炎症相关指标的水平。3.揭示PNS通过活化Nrf2抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注炎症损伤的作用机制。构建OGD/R诱导的细胞模型以及MCAO/R诱导的大鼠模型,实验分假手术组,模型组,Nrf2激动剂组,PNS高剂量组,Nrf2抑制剂组,PNS+Nrf2抑制剂联用组;通过免疫荧光检测各组细胞中Nrf2的入核情况;Western blot检测各组大鼠脑组织中Nrf2总蛋白、核蛋白及胞浆蛋白水平。通过试剂盒检测炎症及铁死亡相关指标,Western blot检测铁死亡调控路径关键蛋白的表达水平,神经功能缺损评分、行为学以及TTC染色检测评价各组大鼠脑损伤程度。结果:1.CCK-8和LDH漏出率检测结果显示:与对照组比较,Erastin和OGD/R模型组细胞活性显著下降,LDH漏出率显著升高;与模型组比较,PNS、Fer-1和DFO组均阻断了上述变化。铁死亡检测显示:与对照组比较,Erastin和OGD/R模型组细胞内Fe~(2+)、MDA、ROS含量显著增加,GSH含量显著减少;与模型组比较,PNS、Fer-1和DFO组细胞内Fe~(2+)、MDA、ROS含量显著降低,GSH含量显著增加。2.TTC染色结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组右侧大脑呈现大片体积白色脑梗死区域;与MCAO/R模型组比较,PNS、Fer-1与DFO组白色脑梗死体积显著减少。神经功能评分与行为学结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠神经功能缺损评分显著增高,贴纸移除时间显著增加,平衡木评分、圆筒实验患侧肢体利用率、攀绳测试评分及时间显著降低;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组神经功能缺损评分显著降低,贴纸移除时间显著减少,平衡木评分、圆筒实验患侧肢体利用率、攀绳测试评分及时间显著增加。铁死亡检测结果显示:与假手术组比较,MCAO/R大鼠脑组织中Fe~(2+)、MDA与LPO含量显著增加,GSH含量获悉更多显著减少;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组Fe~(2+)、MDA与LPO含量显著降低,GSH含量显著增加;Western blot实验结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠脑组织中酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白水平显著增加,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)及重组溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的蛋白水平显著降低;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组ACSL4蛋白水平均显著降低,GPX4及SLC7A11的蛋白水平显著增加。炎症相关指标检测结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO含量显著增高;与MCAO/R组比较,PNS、Fer-1与DFO组IL-1β、IL-6、TNF-α及MPO含量均显著降低。3.细胞免疫荧光实验结果显示:与对照组比较,OGD/R组的Nrf2入核水平显著增加;与OGD/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组的Nrf2入核水平进一步增加;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组的Nrf2入核水平显著降低。另外,大鼠脑组织Western blot检测结果显示:与假手术组比较,MCAO/R组大鼠脑组织中Nrf2总蛋白与核蛋白水平显著升高,Nrf2胞浆蛋白水平显著降低;与MCAO/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组中Nrf2总蛋白与核蛋白水平进一步升高,Nrf2胞浆蛋白水平进一步降低;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组Nrf2总蛋白与核蛋白水平显著降低,Nrf2胞浆蛋白水平显著升高。铁死亡检测结果显示:与MCAO/R组比较,PNS和Nrf2激动剂组Fe~(2+)、MDA、LPO含量显著减少,GSH含量显著增加;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用显著逆转了以上效应。Western blot实验结果显示:与MCAO/R组比较,PNS和Nrf2激动剂组运铁蛋白(FPN)和铁蛋白重链(FTH)以及GPX4、SLC7A11的蛋白水平显著增加;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组铁死亡相关蛋白水平显著降低。炎症相关指标检测结果显示:与MCAO/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组IL-1β、IL-6和TNF-α以及MPO含量显著减少;与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组炎症因子及MPO含量显著增高。最后,脑损伤检测的结果显示:与MCAO/R组比较,PNS与Nrf2激动剂组显著降低脑梗死体积和神经功能缺损评分,显著缓解运动功能障碍。与PNS单用组比较,PNS+Nrf2抑制剂联用组脑梗死体积增加,神经功能缺损症状和运动感觉障碍加重。结论:1.PNS抑制Erastin和OGD/R诱导的铁死亡减轻细胞损伤。2.PNS抑制MCAO/R大鼠脑组织铁死亡和脑缺血再灌注炎症反应。3.PNS通过活化Nrf2抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注炎症损伤。