目的基于超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)非靶向代谢组学研究方法,研究清肾颗粒治疗慢性肾衰竭湿热证的代谢物质基础和相关代谢通路,分析其对肾间质纤维化的影响,并结合网络药理学相关研究,为清肾颗粒治疗慢性肾衰竭湿热证提供科学依据。方法1.代谢组学研究1.1临床研究:CRF湿热证患者、正常人各5例,空腹肘静脉采血,分为健康对照组和CRF湿热证组,利用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)非靶向代谢组学方法对血浆代谢物进行分析,随后进行单变量统计分析、多元统计分析,差异代谢物筛选,并进行KEGG富集通路分析。1.2实验研究:腺嘌呤肾纤维化大鼠:40只大鼠适应性喂养1周,按1:3比例随机分为对照组(C组)10只,造模组30只。将2.5g腺嘌呤与100ml生理盐水混合成悬浮液,按200mg·kg-1·d-1剂量(即0.8ml·100g~(-1)·d~(-1))每日依据大鼠体重,灌胃给药。对照组每天灌胃等量生理盐水。灌胃4周造模完成后,30只大鼠随机分为模型组(M组)和清肾组(Q组)各15只。清肾组以4.0g/kg清肾颗粒水溶液灌胃,每天1次,每次4ml,连续给药12周。每组送检10只大鼠。经腹主动脉采血,部分血样检测Scr、BUN,剩余血样用于代谢组学研究。并收集肾脏组织用于病理检查。利用UPLC-MS非靶向代谢组学方法对血浆代谢物进行分析,随后进行AMG510 IC50单变量统计分析、多元统计分析,筛选差异代谢物,得到清肾颗粒抗肾纤维化的关键靶点;并进行KEGG富集通路分析。2.代谢组学结合网络药理学研究2.1网络药理学研究,通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中医药百科全书数据库(ETCM)、2015版中国药典、中国知网、Pubmed数据库对清肾颗粒全方中药进行检索,构建清肾颗粒中药活性成分靶点。2.2将清肾颗粒与慢性肾衰竭湿热证调控的基因集进行配对,获取复方和疾病二者共同作用基因,其可能是清肾颗粒干预CRF湿热证的潜在靶点。构建“中药-活性成分-交集靶点-疾病”调控网络,对交集靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。2.3代谢组学结合网络药理学研究,动物实验中模型组与清肾组鉴定后差异代谢物名称转化成KEGG的ID,将其导入Cytoscape的Metscap中,构建代谢物-基因靶点网络,筛选到166个基因靶点,与网络药理学中106个交集靶点通过STRING的PPI分析,将两者整合,再次利用网络中的Degree值选出重要的作用靶点结果1.代谢组学结果1.1临床研究通过检索定性后,筛选到47种差异代谢物,主要集中在脂质和脂质样分子、有机酸和衍生物、有机氧化合物等。富集到甘油磷脂代谢,癌症中的胆碱代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等显著性信号通路(p<0.05);癌症中的胆碱代谢为显著性最高(p<0.01)的一条通路,涉及到2个差异代谢物,磷脂酰胆碱(Ptd Cho C00157)、1-酰基甘油磷酸胆碱(1-acyl GPCC04230),参与甘油磷脂代谢及MAPK信号通路。1.2实验研究1.2.1成功构造了腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠模型,实验结果表明清肾颗粒可以降低Scr、BUN含量,减轻大鼠肾脏病理损害,肾间质胶原纤维增生显著降低。1.2.2通过检索定性后,对照组和模型组筛选到33种差异代谢物;模型组和清肾组筛选到25种差异代谢物。与对照组相比,模型组差异代谢物主要集中在脂质和脂质样分子、有机酸和衍生物类等;清肾颗粒给药后,与模型组相比,差异代谢物主要集中在脂质和脂质样分子,而且能下调模型组中上调的5个差异代谢物:磷脂酰胆碱PC(16:0/18:3(9Z,12Z,15Z))、鞘氨醇(Sphinganine)、N2-乙酰鸟氨酸(N2-Acetylornithine)、磷脂酰胆碱PC(18:3(6Z,9Z,12Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))、磷脂酰胆碱Gefitinib-based PROTAC 3分子量PC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/18:3(6Z,9Z,12Z))。1.2.3 KEGG富集分析后,对照组和模型组富集到癌症中的胆碱代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、鞘脂信号通路等显著性代谢通路(p<0.05)。模型组和清肾组富集到癌症中的胆碱代谢、甘油磷脂代谢、氨酰t RNA生物合成等显著性信号通路(p<0.05)。在甘油磷脂代谢、癌症中的胆碱代谢两条代谢通路中,清肾颗粒给药后均能下调Ptd Cho这一差异代谢物。2.清肾颗粒代谢组学与网络药理学分析2.1网络药理学中清肾颗粒干预慢性肾衰竭湿热证的潜在靶点为106个。2.2网络药理学GO中CC富集包括质膜、质膜的组成成分、胞浆等,KEGG富集通路有167条,包括癌症中的胆碱代谢、MAPK信号通路等。2Disaster medical assistance team.3通过韦恩图分析,得到的交集通路为癌症中的胆碱代谢。2.4构建代谢物-基因靶点网络,获得了180个相关基因,PPI分析后有ACTB、JUN、PPARG、PTEN、ESR1、PLD2、PLA2G4A、PLA2G1B、PIK3CA、PLA2G6、CCL2、PRKCB等重要作用靶点。结论1.代谢组学研究得出清肾颗粒治疗CRF湿热证的5个潜在生物标志物,与生物标志物磷脂酰胆碱关系紧密,涉及到甘油磷脂代谢、癌症中的胆碱代谢及MAPK信号通路。2.代谢组学结合网络药理学研究得出清肾颗粒抑制肾纤维化可能与调节脂质代谢紊乱,减轻机体炎症反应有关,作用途径可能与癌症中的胆碱代谢、MAPK信号通路关系较为密切。