PLC-γ1的多克隆抗体制备及对绵羊早期胚胎发育作用的初步研究

旨在通过构建PLC-γ1真核过表达载体并制备其多克隆抗体,为探索绵羊PLC-γ1基因对卵母细胞激活作用及早期胚胎发育的影响提供基础数据。本研究以实验室保存的Puc57-P2Asport and exercise medicine-Flag-PLC-GW4869小鼠γ1菌株为模板设计引物并引入HindⅢ、AgeⅠ酶切位点,利用PCR扩增并纯化P2A-Flag-PLC-γ1基因,将其连入pcDNA3.1-EGFP载体,进行转化,通过菌液PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染HEK-293T细胞24 h,分为control组、空载组和PLC-γ1过表达组,通过显微镜观察细胞荧光,实时荧光定量PCR(qPCR)及Western blot(WB)检测转染后细胞中PLC-γ1的表达情况;Anti-Flag免疫磁珠纯化PLC-γ1蛋白;以10月龄的新西兰大白兔(健康状态良好,体重约50 kg,n=2)为对象制备多克隆抗体,间接ELISA法测定多克隆抗体效价,WB鉴定其特异性。通过显微注射重组质粒及离子霉素(Ion)结合6-DMAP孤雌激活卵母细胞,qPCR及WABT-263B检测PLC-γ1在卵裂后不同时期(2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑椹胚期)的绵羊早期胚胎细胞中的表达情况。结果显示,成功构建真核过表达载体;转染24 h后,与空白对照及阴性对照相比,过表达组PLC-γ1表达量明显升高(P<0.01);WB结果显示成功获得并纯化PLC-γ1蛋白,大小为149 ku;测得PLC-γ1多克隆抗体效价为1∶12 800,并可与PLC-γ1蛋白发生免疫反应。将重组质粒注射到绵羊MⅡ期卵母细胞胞质中,qPCR及WB结果显示PLC-γ1在绵羊早期胚胎发育各时期均有表达。综上所述,本研究成功构建了PLC-γ1真核过表达载体并制备了其多克隆抗体,通过显微注射技术将重组质粒注入卵母细胞并实现表达,证明PLC-γ1在绵羊早期胚胎发育各时期均有表达,且具有作为新的卵母细胞激活因子的潜能。既为探索绵羊PLC-γ1基因对卵母细胞激活作用及早期胚胎发育的影响提供了科学依据,也为进一步提升绵羊的繁殖性能奠定基础。