目的:研究替普瑞酮(Geranylgeranylacetone,GGA)对百草枯(Paraquat,PQ)诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型的神经保护作用,并进一步探讨GGA对该氧化应激损伤模型中TDP-43(35Kda)蛋白聚集及氧化应激水平的影响。方法:1.建立SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型。分组:(1)对照组,(2)模型组。根据文献,采用1m M PQ处理SH-SY5Y细胞24小时,建立氧化应激损伤模型;采用CCK8法检测SH-SY5Y细胞的存活率,采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)与免疫荧光染色法(Immunofluorescent staining,IF)检测TDP-43(35Kda)蛋白的表达。2.观察GGA对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型的保护作用。2.1观察GGA对SH-SY5Y氧化应激损伤模型中细胞存活率的影响。分组:(1)对照组,(2)模型组,(3)GGA处理组:应用20μM,50μM,100μM和200μM的GGA处理SH-SY5Y细胞27小时,(4)GGA处理模型组:应用20μM,50μM,100μM和200μM的GGA预处理SH-SY5Y细胞3小时,再用1m M PQ处理细胞24小时。采用CCK8法检测各组SH-SY5Y细胞的存活率,并确定最佳药物浓度。2.2观察GGA对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中细胞凋亡率的影响。分组:(1)对照组,(2)模型组,(3)GGA处理模型组:应用100μM的GGA预处理SH-SY5Y细胞3小时,再用1m M PQ处理细胞24小时。采用Annexin V-FITC和PI双染法检测各组细胞的凋亡率。2.3观察GGA对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中TDP-43(35Kda)蛋白异常聚集的影响。分组:(1)对照组,(2)模型组,(3)GGA处理模型组:应点击此处用100μM的GGA预处理SH-SY5Y细胞3小时,再用1m M PQ处理细胞24小时。采用WB检测TDP-43(35Kda)蛋白表达水平。3.观察GGA对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中氧化应激水平的影响。分组:(1)对照组,(2)模型组,(3)GGA处理模型组:应用100μM的GGA预处理SH-SY5Y细胞3小时,再用1m M PQ处理细胞24小时,(4)Nrf2抑制剂组:应用1.9μM的Nrf2抑制剂ML385处理细胞1小时,换液后再用100μM的GGA处理SH-SY5Y细胞3小时,最后用1m M PQ处理细胞24小时。3.1观察GGA在SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中对ROS及其清除酶的影响。利用相应试剂盒检测各组SH-SY5Y细胞的活性氧(ROS)、丙二醛(MDANK cell biology)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)水平。3.2观察GGA对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中线粒体膜电位(MMP)的影响。利用JC-1试剂盒检测各组MMP水平。3.3观察GGA对Nrf2、HO-1、TDP-43(35Kda)蛋白表达的影响。采用蛋白质印迹法检测Nrf2、HO-1、TDP-43(35Kda)蛋白表达水平。结果:1.建立SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型。CCK8、WB和IF结果显示,与对照组相比,模型组细胞存活率明显降低(P<0.001),细胞质内TDP-43(35Kda)点状荧光明显增多,TDP-43蛋白(35Kda)表达明显增多(P<0.0001)。2.GGA对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型具有神经保护作用。2.1 GGA对SH-SY5Y细胞无明显细胞毒性,且增加了氧化应激损伤模型中细胞的存活率。CCK8结果显示,与对照组相比,GGA处理组的细胞存活率变化不显著(P更多>0.05);与模型组相比,GGA处理模型组在一定范围内以浓度依赖的方式增加了细胞存活率(P<0.05),且100μM的GGA处理模型组细胞存活率最高,因此本实验把此浓度设为最佳药物浓度,用于后续实验。2.2 GGA降低SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型的细胞凋亡率。流式分析结果显示,与对照组相比,模型组细胞凋亡率显著增加(P<0.0001);与模型组相比,100μM GGA处理模型组细胞凋亡率显著降低(P<0.0001)。2.3 GGA减少SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中TDP-43(35Kda)蛋白的异常聚集。WB结果显示,与对照组相比,模型组TDP-43(35Kda)蛋白表达明显增加(P<0.0001);与模型组相比,100μM GGA处理模型组TDP-43(35Kda)蛋白表达明显降低(P<0.001)。3.GGA抑制SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型的氧化应激水平。3.1 GGA降低了SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中ROS水平,增加了ROS清除酶活性。实验结果显示,与对照组相比,模型组的ROS及MDA显著增加(P<0.0001),SOD、CAT、GPx显著降低(P<0.0001);与模型组相比,100μM GGA处理模型组ROS及MDA显著降低(P<0.0001),SOD、CAT、GPx显著增加(P<0.001);与100μM GGA处理模型组相比,Nrf2抑制剂组ROS及MDA显著增加(P<0.001),SOD、CAT、GPx显著降低(P<0.001)。3.2 GGA减少了SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型中线粒体膜电位的损伤。流式结果显示,与对照组相比,模型组的MMP显著降低(P<0.0001);与模型组相比,100μM GGA处理模型组MMP显著增加(P<0.0001);与100μM GGA处理模型组相比,Nrf2抑制剂组MMP显著降低(P<0.001)。3.3 GGA通过激活Nrf2/HO-1通路减少了TDP-43(35Kda)蛋白的异常聚集。WB结果显示,与模型组相比,100μM GGA处理模型组Nrf2蛋白及HO-1蛋白显著增加(P<0.0001),TDP-43(35Kda)蛋白表达水平显著降低(P<0.0001);与100μM GGA处理模型组相比,Nrf2抑制剂组Nrf2蛋白及HO-1蛋白显著降低(P<0.001),TDP-43(35Kda)蛋白表达水平显著增加(P<0.0001)。结论:我们的研究表明,GGA对PQ诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型具有神经保护作用。GGA可能通过部分激活Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激水平、减少线粒体损伤、降低TDP-43(35Kda)蛋白的异常聚集发挥作用,提示GGA可能对肌萎缩侧索硬化的治疗具有潜在意义。