利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）Quaking基因敲除细胞株，并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先，利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA，成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外Elexacaftor显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中，通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次，将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒（LentiCRISPRv2-sgRNA1）与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装，慢病Oncology nurse毒转导NIH3T3细胞后，利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后，通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】LY2157299 IC50发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达，并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现，Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）Quaking基因敲除细胞株，为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。